Статьи

 

"Микробиология 21 века"

Прошел год c тех пор, как в нашей лаборатории был установлен масс-спектрометр «Бактоскрин» для идентификации микроорганизмов – разработка московской компании НПФ Литех, первый отечественный анализатор. Это вывело микробиологические анализы на совершенно иной уровень.

Для того, чтобы понять, насколько значимым было это изменение, необходимо иметь представление о том, как в настоящее время проводятся микробиологические анализы в подавляющем большинство лабораторий.

Начинается любое исследование с того, что биологическим материалом, взятым у пациента, засевают чашки с питательной средой, которые помещают в термостат. Микроорганизмы, содержащиеся в биоматериале, начинают усиленно расти и размножаться.

На рисунке изображены два вида колоний, выросшие на питательной среде. Врач-микробиолог должен определить, какие именно это бактерии, чтобы лечащий врач мог назначить лечение.

Через сутки невидимые ранее микроорганизмы вырастают, их колонии становятся хорошо видны. Но что именно выросло на чашке – на этот вопрос предстоит ответить врачу микробиологу. Колонию кишечной палочки узнает даже начинающий врач. Но, к сожалению, в образцах растет не только кишечная палочка. Во многих случаях, чтобы определить, какие именно микробы образовали колонию, т.е. какие именно микробы содержались в образцах, необходимо проводить специальные исследования. Для этого выросших микробов окрашивают специальными красителями, рассматривают под микроскопом, засевают ими наборы различных сред, а потом в течение нескольких дней наблюдают, какие изменения будут происходить в этих средах в результате жизнедеятельности микробов.

Рисунок показывает набор пробирок, содержащих различные углеводы. Потребление микробом конкретного углевода приводит к изменению окраски добавленного индикатора, поэтому такой набор называют «пестрый ряд». Врач определяет, каким именно микробом был засеян ряд в зависимости от того, в каких пробирках произошло изменение цвета.

Что было бы, если бы подобные методы использовались бы для идентификации людей – например, полицейскими? Представьте себе, полиция задержала подозреваемого и хочет его опознать так, как это делают микробиологи с микробами. Для этого подозреваемого селят в гостиницу и несколько дней наблюдают за ним – во сколько он ложиться спать, во сколько встает, что ест на завтрак. А еще собирают и анализируют отходы его жизнедеятельности.

Нелепо, скажите вы. Но именно так обстоят дела в микробиологии! Врач в течение нескольких дней наблюдает за тем, какие изменения происходят в средах, в которых растет микроб. Как меняется окраска индикаторов, происходит ли выделение пузырьков и т.д. Потом, учитывая все изменения, по специальным таблицам врач определяет, к какому роду и виду относиться микроб.
Недостатки данного метода очевидны:
   - Во-первых и в главных – время. Необходимо несколько дней, чтобы определить таким образом микроорганизм, и эти несколько дней врач не может начать лечение, не зная, от чего лечить.
   - Во-вторых – точность. Упомянутые таблицы содержат несколько сотен наименований микробов – а всего человеческий организм могут населять тысячи и десятки тысяч различных микробов.

К счастью, никто не помещает подозреваемых в гостиницу и не наблюдает за ними по несколько дней. У полицейских есть такой мощный инструмент, как дактилоскопия. Отпечаток пальцев каждого человека индивидуален. Поэтому, взяв отпечаток пальца и сравнив его отпечатками, хранящимися в базе данных, полиция без труда идентифицирует человека (если, конечно, его отпечаток есть в базе).

А что же микроорганизмы? Ученые установили, что набор рибосомальных белков любого микроорганизма уникален, как уникален рисунок капиллярных линий у человека. Если научиться определять состав белков микроба, то идентифицировать его будет также просто, как человека по отпечатку пальца.

Впервые для опознания преступника дактилоскопия была применена в 1902 г. Ровно через 100 лет, в 2002 г., японский ученый Коити Танака получил Нобелевскую премию за исследования, позволившие создать революционный метод идентификации микробов, называемый иногда «протеомная дактилоскопия».

Сравнительно недавно у биологов появился инструмент, который позволяет это делать. Таким образом, стал возможен принципиально другой способ идентификации микробов. Теперь вместо того, чтобы рассеивать микробы по набору различных сред и в течение несколько суток наблюдать за ними, выросшую колонию наносят на стальную мишень. Сверху наслаивается специальное вещество – матрица. Затем лазерная вспышка превращает живой организм в набор ионов. Состав этих ионов анализируется масс-спектрометром, измеряется масс-спектр набора белков. Как мы уже знаем, этот масс-спектр уникален для каждого вида микроба, как отпечаток пальца для человека (поэтому этот метод еще называют «протеомная дактилоскопия»). Программное обеспечение осуществляет поиск подходящего спектра в базе данных, в которой хранятся сведения о нескольких тысячах микроорганизмов – бактерий, микобактерий, мицелиальных и дрожжевых грибов.

Использование матрицы позволило применить метод масс-спектрометрии для анализа биологических объектов. Масс-спектр работает с ионами – т.е., фактически, с плазмой. Типичный пример плазмы – дуга электросварки. Представьте себе, что произойдет с живым существом, оказавшимся внутри дуги. И здесь на помощь приходит матрица. Ее молекулы поглощают энергию лазерной вспышки, «вскипают» и увлекают за собой молекулы белка, защитив их от разрушения лазером.

Таки образом, от нанесения образца на мишень до получения результата проходит несколько минут. Сравните это с несколькими сутками, которые требуются в традиционном методе.

Так выглядит белковый масс-спектр – аналог отпечатка пальцев человека. Слева изображен первый отечественный масс-спетрометрический биоанализатор Бактоскрин.

Это означает, что уже через сутки после первичного посева врач-микробиолог может определить возбудителя заболевания и начать исследование по устойчивости к антибиотикам. При этом точность определения будет намного выше. База данных прибора содержит в десять раз больше микроорганизмов, чем таблицы, используемые в традиционных методах.
Расширенная база данных дает возможность определять микробы, которые невозможно определить традиционными методами. За истекший год эксплуатации прибора наши врачи не однократно идентифицировали микроорганизмы, которые отсутствуют в обычных справочниках врачей-микробиологов. Если бы образцы этих пациентов анализировались традиционными методами, микробы остались бы не идентифицированным. А это уже прямая угроза для здоровья. Неизвестный микроб может быть сапрофитом кожи, не требующим лечения, как например, Brevicbacterium, а может быть патогенном, требующим эродикации (уничтожения), как, например Pasteurella multocida. Или найденная в ране одного из пациентов Aeromonas hydrophila. Данная бактерия обитает в теплых южных морях, не определяется традиционными методами, хотя является весьма патогенной для человека. Использование же масс-спектрометра позволило определить эти и ряд других бактерия, отсутствующие в стандартных справочниках.

Безусловно, будущее микробиологических исследований связано с масс-спектрометрической идентификацией. Данный метод превосходит любой существующий в настоящее время – и по скорости и по качеству определения. В настоящее время лаборатория «Сиблабсервис» - единственная в Новосибирске, использующая масс-спектрометрию для коммерческих бактериологических анализов. Единственное место в Новосибирске, где будущее наступило уже сегодня.